細(xì)胞名稱：人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞-永生化
種屬：人
組織來源：視網(wǎng)膜
永生化方法：轉(zhuǎn)入 Sv40 T 基因
培養(yǎng)特性：貼壁
安全性：所有腫瘤和病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作， 并請(qǐng)注意防護(hù)

配套培養(yǎng)基：內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液

溫度：37 ℃
氣相：95%空氣，5%二氧化碳細(xì)胞復(fù)蘇：注意:1.低溫保存的細(xì)胞非常脆弱，請(qǐng)將凍存管放入 37℃的水浴中解凍，盡快復(fù)蘇細(xì)胞。2.提前室溫預(yù)熱培養(yǎng)基。
1.在無菌區(qū)準(zhǔn)備好 T-25 培養(yǎng)瓶加入約 5ml 培養(yǎng)基。
2.將凍存管放入 37℃水浴中，握住凍存管晃動(dòng)，直到內(nèi)容物完全融化。立即將凍存管從水浴中取出，擦干并噴灑 75%乙醇，移至無菌區(qū)。
3.小心地拆卸蓋子，不要碰到里面的螺紋，用移液槍輕輕吸出細(xì)胞，加入到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶中。
注意:由于本公司采用 Sciencell 公司凍存液，因此不建議在解凍后進(jìn)行細(xì)胞稀釋和離心。
4.輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞均勻分布。如有必要，松開閥蓋，以便氣體交換。
5.將培養(yǎng)瓶放入 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6.過夜后，觀察細(xì)胞形態(tài)并更換培養(yǎng)基。傳代：收到細(xì)胞后，請(qǐng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶外表進(jìn)行消毒，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行 1-2 小時(shí)的緩沖， 待細(xì)胞恢復(fù)基本生長(zhǎng)狀態(tài)后，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
在倒置顯微鏡下觀察整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況：
（一）細(xì)胞未長(zhǎng)至 85%時(shí)，用 75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到生物操作臺(tái)內(nèi)，嚴(yán)格無菌操作，打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶，若培養(yǎng)瓶上無特殊標(biāo)注，吸去剩余培養(yǎng)液，只留 6-8ml 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
（二）細(xì)胞已長(zhǎng)滿（達(dá) 85-95%）。即可進(jìn)行傳代，具體步驟如下：
1.棄去培養(yǎng)液，用PBS 洗滌 1-2 次；
2.加入 1.0ml 胰酶消化液，37℃消化約 3min，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞回縮變圓、透亮、輕拍甁壁呈流沙樣脫落，則迅速拿回操作臺(tái)，加入至少雙倍的終止液，終止消化并輕輕吹打細(xì)胞，使其變成單細(xì)胞懸液；
3.將細(xì)胞收集于離心管中離心 1000rmp/5min，棄上清，輕彈管底，將細(xì)胞彈散；
4.加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行傳代；
5.如果沒有特別說明，建議收到細(xì)胞后的第一次傳代比例為 1:2。
注：1.觀察細(xì)胞密度最好用（4X 物鏡）低倍鏡觀察，以便正確的判斷細(xì)胞密度；觀察細(xì)胞形態(tài)請(qǐng)用（10X 或 20X）高倍鏡觀察；
2.推薦使用 0.05%胰酶/EDTA 消化液;
3.瓶中運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)液不能重復(fù)使用，請(qǐng)換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)；
4.有些細(xì)胞貼壁不牢，如發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞有脫落，可離心重懸后接種到新瓶?jī)?nèi)。 凍存條件：70%基礎(chǔ)培養(yǎng)液+20%胎牛血清+10%DMSO 保存條件：液氮存儲(chǔ)
供應(yīng)限制： 僅供研究之用
常見問題及解決方案
1.在收到細(xì)胞后先觀察培養(yǎng)瓶是否破裂，漏液等，如遇到上述問題請(qǐng)及時(shí)拍照并與我們聯(lián)系。
2.貼壁細(xì)胞：培養(yǎng)瓶不開封，顯微鏡下檢查細(xì)胞狀態(tài)，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養(yǎng)箱。
1-2 小時(shí)后觀察，如細(xì)胞大部分又貼回瓶底，表明細(xì)胞活力正常，剩余少量漂浮的細(xì)胞可以去掉，留 8-10ml 培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度到達(dá) 85%左右，進(jìn)行消化傳代； 如細(xì)胞仍不貼壁，將細(xì)胞離心收集轉(zhuǎn)到新培養(yǎng)瓶，原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，注意觀察。如細(xì)胞仍不能貼壁，請(qǐng)用臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活力，并請(qǐng)及時(shí)拍照（多倍數(shù)多視野）， 包括染色照片，并聯(lián)系我們。（以上僅為貼壁細(xì)胞處理方法）
3.懸浮細(xì)胞：培養(yǎng)瓶不開封，顯微鏡下檢查細(xì)胞狀態(tài)，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養(yǎng)箱。
1-2 小時(shí)后觀察，將整瓶細(xì)胞及培養(yǎng)液分批離心（1000rmp, 5min），加入適量培養(yǎng)基，根據(jù)離心后的細(xì)胞量進(jìn)行放回培養(yǎng)或分瓶培養(yǎng)。（以上僅為懸浮細(xì)胞處理方法）
4.半懸細(xì)胞：培養(yǎng)瓶不開封，顯微鏡下檢查細(xì)胞狀態(tài)，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養(yǎng)箱。
1-2 小時(shí)后觀察，將整瓶細(xì)胞培養(yǎng)液上層懸浮細(xì)胞離心（1000rmp, 5min），重懸細(xì)胞后加入原培養(yǎng)瓶培養(yǎng)至傳代。細(xì)胞數(shù)量較大，可將貼壁細(xì)胞消化下來，與上層懸浮細(xì)胞混勻傳代。重懸上層懸浮細(xì)胞時(shí)必須保持下層貼壁細(xì)胞的營養(yǎng)條件，防止貼壁細(xì)胞缺乏營養(yǎng)。（以上僅為半懸細(xì)胞處理方法）
如遇到細(xì)胞培養(yǎng)問題請(qǐng)及時(shí)拍照并與我們聯(lián)系，我們的技術(shù)人員會(huì)一直跟蹤指導(dǎo)。