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培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查和觀察方法

 細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中需要每天進(jìn)行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察,及時(shí)了解細(xì)胞生長狀態(tài)、數(shù)量改變、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞有無移動、有無污染、培養(yǎng)液pH是否變酸、變黃是否更換等。細(xì)胞常規(guī)檢查觀察的內(nèi)容為:
一、肉眼觀察
一般常規(guī)檢查用肉眼即可觀察,主要看培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化。正常情況下,培養(yǎng)液pH介于7.27.4之間,呈桃紅色清亮透明。加入細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中置一般溫箱培養(yǎng)時(shí),隨著細(xì)胞生長時(shí)間的延長,細(xì)胞代謝產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物會使培養(yǎng)液pH值下降,引起顏色變淺變黃。在超越緩沖范圍后培養(yǎng)液酸化變黃,如不及時(shí)調(diào)節(jié)pH,會影響細(xì)胞的生長,甚至造成細(xì)胞退變死亡。所以,一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃,應(yīng)及時(shí)換液傳代。一般更換培養(yǎng)液的時(shí)間,依營養(yǎng)物的消耗而定,正常情況生長穩(wěn)定的細(xì)胞23天換液一次,生長緩慢的細(xì)胞34天換液一次。培養(yǎng)液中加Hepes或用5%CO2溫箱培養(yǎng)可使pH維持穩(wěn)定,利于細(xì)胞生長。用含磷酸鹽緩沖系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí),可因瓶及塞子漏氣,CO2溢出,也可能由于培養(yǎng)瓶塞洗刷不潔、殘留堿性物,使培養(yǎng)液變堿發(fā)紅,只致使細(xì)胞難以生長,甚至死亡。細(xì)胞換液傳代后,若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液很快變黃,要注意是否有細(xì)菌污染或培養(yǎng)器皿沒有洗干凈。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)若出現(xiàn)混濁,多為污染。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,應(yīng)將瓶豎起靜置1小時(shí),若培養(yǎng)基混濁示為污染,也可在顯微鏡下仔細(xì)觀察有無污染現(xiàn)象出現(xiàn)。
二、顯微鏡觀察
生長良好的細(xì)胞,在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞透明度大,折光性強(qiáng),輪廓不清。相差顯微鏡觀察時(shí)可見細(xì)胞部分細(xì)微結(jié)構(gòu)。若細(xì)胞生長狀態(tài)不良,可見細(xì)胞輪廓增強(qiáng),細(xì)胞折光性變?nèi)?,?xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì),細(xì)胞之間空隙增大,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn),產(chǎn)生圓縮脫落,有時(shí)細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。若細(xì)胞營養(yǎng)不良狀況沒有得到及時(shí)糾正,進(jìn)一步發(fā)展可見到部分細(xì)胞死亡,崩解漂浮在培養(yǎng)液中。發(fā)現(xiàn)這種情況應(yīng)及時(shí)處理,只有生長良好的細(xì)胞才能進(jìn)行傳代培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)研究。
三、細(xì)胞的生長狀態(tài)
細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),經(jīng)初代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng),都有一長短不同的潛伏期,在培養(yǎng)過程中注意觀察細(xì)胞增殖生長的狀態(tài)極為重要。各種細(xì)胞增殖的時(shí)間不盡一致。傳代細(xì)胞系,胚胎組織或幼體細(xì)胞潛伏期短,一般在接種培養(yǎng)第二天即可見細(xì)胞生長增殖,34天便可連接成片。成體組織的潛伏期長,老年組織和癌組織潛伏期更長,可達(dá)一周左右。原代細(xì)胞培養(yǎng)中最先可見從組織塊中邊緣“長出”細(xì)胞,這種細(xì)胞是從原代組織塊中游走出來的,并不是細(xì)胞增殖產(chǎn)生。這種早期游出的細(xì)胞多以成纖維細(xì)胞為主,其易生長,適應(yīng)性強(qiáng),呈放射狀或旋渦狀分布,很快生長并互相連接成網(wǎng)狀。傳代細(xì)胞在傳代后,一般經(jīng)過懸浮、貼壁伸展很快進(jìn)入潛伏期,對數(shù)生長期,細(xì)胞大量繁殖,逐漸相連成片而長滿瓶底。一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞長滿瓶底80%就應(yīng)及時(shí)傳代,否則會影響細(xì)胞生長甚至脫落。懸浮細(xì)胞當(dāng)發(fā)現(xiàn)生長顯著、密度增大、分布稠密、培養(yǎng)液變黃時(shí)也應(yīng)及時(shí)傳代。
四、微生物污染
細(xì)胞接種、傳代、換液加藥后應(yīng)經(jīng)常觀察,密切注意是否有微生物污染發(fā)生。一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液混濁、液體內(nèi)漂浮著菌絲或細(xì)菌,或生長明顯變緩,胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多,有中毒表現(xiàn)等應(yīng)懷疑是否有微生物污染,進(jìn)一步觀察檢查并及時(shí)處理。
 
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