大腸菌群是經(jīng)常用來衡量食品衛(wèi)生情況的重要指標(biāo)，絕大部分食品都會要求檢測的項(xiàng)目。在食品微生物實(shí)驗(yàn)室里，大腸菌群和菌落總數(shù)的檢測頻次應(yīng)該是最高的，但檢測過程中總會有一些小問題困擾著大家，以下來講解一下大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的注意事項(xiàng)。
一、方法的選擇
相比于MPN計(jì)數(shù)法，平板計(jì)數(shù)法更適用于大腸菌群含量較高的食品。但大腸菌群多少算是含量較高呢？國標(biāo)里沒有明確規(guī)定，但通常認(rèn)為，產(chǎn)品大腸菌群以100CFU/g（mL）為界，超過這個(gè)含量一般認(rèn)為是含量較高。但具體什么時(shí)候選用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行大腸菌群的檢測，大部分情況還是要看你的產(chǎn)品執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)。假如產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求大腸菌群含量的單位為CFU/g（mL），那必須選用平板計(jì)數(shù)法。若是/g(mL)或者M(jìn)PN/100g(mL)，就應(yīng)選擇MPN計(jì)數(shù)法，MPN法具體選用哪版國標(biāo)此處不再贅述。因此，根據(jù)自己產(chǎn)品的情況選擇適當(dāng)?shù)臋z測方法。
二、培養(yǎng)基的要求
平板計(jì)數(shù)法使用的培養(yǎng)基為結(jié)晶紫中性膽鹽瓊脂培養(yǎng)基，簡稱VRBA。無論是國標(biāo)，還是培養(yǎng)基的使用說明中都明確表示，VRBA是不需要進(jìn)行滅菌的，煮沸2min即可使用。特地點(diǎn)出這一點(diǎn)是因?yàn)楹芏嗯笥讯荚趩朧RBA的滅菌條件，對不滅菌的培養(yǎng)基不信任，害怕出現(xiàn)檢測異常，那是因?yàn)檫@些小伙伴們對其中的原理不清楚。大腸菌群的定義是在一定培養(yǎng)條件下能夠在發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，因此大腸菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培養(yǎng)基煮沸的過程中，即使有大腸菌群存在也會被殺滅，所以從培養(yǎng)基帶入污染的可能性是沒有的。當(dāng)然盛裝培養(yǎng)基的容器是需要進(jìn)行滅菌的，以免容器引入污染。另外，VRBA是一種選擇性的培養(yǎng)基，含有的結(jié)晶紫對革蘭氏陽性菌有比較強(qiáng)的抑制作用而對革蘭氏陰性菌幾乎沒有作用，而且平板培養(yǎng)產(chǎn)生的菌落還需要進(jìn)行復(fù)發(fā)酵的驗(yàn)證，因此VRBA培養(yǎng)基就不需要進(jìn)行滅菌了。但值得注意的是，VRBA需要現(xiàn)配現(xiàn)用，配制出的培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)在3h之內(nèi)使用完畢。
三、稀釋度的確定
國標(biāo)中要求選擇2-3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度。什么樣的稀釋度是合適的呢？這要根據(jù)計(jì)數(shù)來決定。計(jì)數(shù)環(huán)節(jié)要求選擇菌落數(shù)在15CFU-150CFU的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，因此培養(yǎng)后菌落數(shù)在這個(gè)范圍內(nèi)的稀釋度就是適宜的稀釋度。實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常檢測的產(chǎn)品的大腸菌群的水平檢測人員可以預(yù)計(jì)的，但是對盲樣，我們能做的只有根據(jù)實(shí)際情況多檢測幾個(gè)稀釋度了。這里需要提一句，液體樣品的檢測稀釋度可以包括原液。
四、證實(shí)試驗(yàn)
需要從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，少于10個(gè)菌落的挑取全部的典型和可疑菌落進(jìn)行BGLB肉湯管驗(yàn)證。這里挑取的菌落也是應(yīng)當(dāng)有選擇的，典型菌落和可疑菌落的比例應(yīng)當(dāng)與平板上培養(yǎng)的兩種菌落的比例相同或相近，這樣能夠降低檢測過程中的誤差。
五、計(jì)數(shù)的報(bào)告
報(bào)告過程是很多朋友存在疑問的地方，因?yàn)槠桨逵?jì)數(shù)法的結(jié)果報(bào)告需要結(jié)合培養(yǎng)基菌落數(shù)和復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證兩方面進(jìn)行計(jì)算。存在疑問的情況主要有以下幾種：
1、所有稀釋度都不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)怎么辦？
這種情況一般都是最低稀釋度的平板都小于15CFU，這種情況就是以最低稀釋度的平板菌落數(shù)乘以驗(yàn)證試驗(yàn)的比例來計(jì)算。例如10倍稀釋的兩個(gè)平板上菌落數(shù)分別為10、8，菌落數(shù)為10的平皿挑取10個(gè)菌落復(fù)發(fā)酵中有8個(gè)菌落產(chǎn)氣，菌落數(shù)為8的平皿挑取8個(gè)菌落復(fù)發(fā)酵中有7個(gè)菌落產(chǎn)氣，則計(jì)算過程是這樣的：(10*8/10+8*7/8)/2*10=75CFU/g（mL）。
2、連續(xù)兩個(gè)稀釋度的四個(gè)平皿的菌落數(shù)都在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)怎么辦？
這個(gè)需要參考菌落總數(shù)檢測國標(biāo)里7.1.2里的公式計(jì)算。我們需要先計(jì)算每個(gè)平皿的驗(yàn)證后的菌落數(shù)，再代入公式計(jì)算即可。例如10倍稀釋度兩個(gè)平皿菌落數(shù)為120和125,100倍稀釋度兩個(gè)平皿的菌落數(shù)為17和16，經(jīng)過復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證產(chǎn)氣的管數(shù)分別為7、8、8、8，則我們先計(jì)算每個(gè)平皿上的菌落數(shù)分別為120*7/10=84,125*8/10=100,17*8/10=13.6（我們計(jì)14），16*8/10=12.8（我們計(jì)13），然后將84、100、14、13四個(gè)數(shù)代入公式：（84+100+14+13）/（2+0.2）*10=959，結(jié)果應(yīng)報(bào)告960CFU/g（mL）。
3、只有一個(gè)稀釋度的一個(gè)平皿的菌落數(shù)在計(jì)數(shù)范圍，其他均不在計(jì)數(shù)范圍怎么辦？
這樣我們只需要復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證這一個(gè)平皿即可，根據(jù)這一個(gè)平皿的菌落數(shù)進(jìn)行報(bào)告。例如10倍稀釋度兩個(gè)平皿菌落數(shù)為160和142,100倍稀釋度兩個(gè)平皿的菌落數(shù)為12和13，則我們只需要從菌落數(shù)為142CFU的平皿里挑取10個(gè)菌落進(jìn)行復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證即可，假如共有7支發(fā)酵管陽性，則應(yīng)計(jì)算142*7/10=99.4，結(jié)果報(bào)告99CFU/g（mL）。
其實(shí)只要是平板菌落計(jì)數(shù)的相關(guān)問題，我們都應(yīng)按照GB 4789.1-2016里要求的結(jié)果與報(bào)告要求進(jìn)行計(jì)算和報(bào)告即可，無論那種情況，都是萬變不離其宗的。
